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β-半乳糖苷酶(β-GAL)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键水解，还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还可以多糖代谢、细胞壁组分代谢过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖，在食品工业、生物技术和医药等领域发挥着重要作用。

LacZ是常用的报告基因，作为转染的参照体系。其蛋白产物β-半乳糖苷酶(β- galactosidase)性质稳定，活性容易测定。

• 细菌/细胞样本准备：收集1～2mL(＞10⁷个)细菌或细胞到离心管内，12000rpm，4℃离心5min，弃上清收集细胞沉淀。
  
• 组织样本准备：将组织液氮研磨成粉末状，称取约20～60mg粉末置于冰上待用。
  
• 液体样本准备：澄清的液体直接检测；若浑浊则离心后取上清检测。

• 用100μL预冷A液(提取液)悬浮沉淀，并快速转移到1.5mL离心管中。
  
• 加入0.05g的酸洗玻璃珠，在旋涡震荡器上剧烈震荡混合5～10min(间歇冰浴冷却)。
  
• 用移液器或者巴斯德吸管回收提取液。
  
• 再加入100μL预冷A液(提取液)到剩余的玻璃珠中，稍加震荡，再次回收提取液。
  
• 合并两次所得提取液即为总蛋白样品。
  
• 12000rpm，4℃离心15min，取上清。提取总蛋白样品直接用于后续活性检测实验或-80℃保存备用。
  
• 利用自备的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

• 酶标仪/分光光度计预热30min以上，温度设定37℃，调节波长至420nm，空白组调零。
  
• 在离心管中依次加入：
  

  成分	测定组	对照组	空白组
  总蛋白	30μL	30μL
  ONPG	70μL		70μL
  去离子水		70μL	30μL
  B液(缓冲液)	200μL	200μL	200μL
  测定至少三种不同体积的裂解液(即10、20、30μL)。吸光度的变化与测定的裂解液量成线性关系。如果不是，将无法得到准确的测定结果。混匀后37℃静置30min。
  C液(终止液)	500μL	500μL	500μL
  混匀后，置于420nm波长的酶标仪/分光光度计中测量吸光值A，ΔA=A测定－A对照，每个测定管需设一个对照管。

  注：若ΔA过小，可以延长保温时间(如：40min或更长)，或增加样本上样量V1(如增至30μL，则去离子水相应减少)，则改变后的T或V1需重新代入计算公式计算。

• 无标准品蛋白活性计算方法：
  活性= nmoles of ONPG hydrolyzed/t/mg protein
  

  nmoles of ONPG hydrolyzed=	OD420×(8×105nL)
  	4500nL·nmoles-1·cm-1×1cm

  
  说明：where 4500 is the extinction coefficient
  t = the time of incubation in minutes at 37℃ (i.e.30minutes)
  and mg protein is the amount of protein assayed
  
• 自备标准品蛋白活性计算方法：
  
  • 利用标准浓度ONP标准曲线方程；
    
  • 将检测吸光值带入标准曲线方程；
    
  • 酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解1nmol ONPG产生ONP定义为1个酶活单位。
    β-GAL活性(nmol/min/mg protein)=ONP物质的量÷(V×Cpr)÷T
    V1：加入蛋白体积；Cpr：蛋白浓度；T：反应时间